近日，上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室邓子新团队康前进研究小组于国际权威期刊《自然·通讯》（Nature Communications）杂志上发表题为“Insertion sequence transposition inactivates CRISPR-Cas immunity”的研究论文。上海交大博士研究生盛勇和王珩瑜两位同学为该论文的共同第一作者。上海交大康前进副研究员、白林泉教授与邓子新教授为共同通讯作者。该研究还得到了林双君教授、陶美凤教授、丁伟特别研究员、唐满成特别研究员和上海农业科学院吴莹莹副研究员的大力支持。
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该工作首先通过综合应用生物信息学、分子生物学、遗传学和基因组学等多种技术手段，揭示了细菌如何利用插入序列（insertion sequences, ISs）在遗传防御与有益外源基因获取之间进化的权衡。在长期的生物进化长河中，CRISPR-Cas免疫系统被认为是广泛存在于细菌和古菌中的一种适应性免疫系统，可以有效保护宿主免受噬菌体和其他可移动元件的入侵。然而，从进化的角度来看，CRISPR-Cas免疫系统却是一把“双刃剑”。一方面，它可以抵御外来遗传物质的入侵，但同时也会限制有益外源基因的获取，在一定程度上阻碍了细菌在胁迫环境中的适应性进化。
图1.IS元件转座至CRISPR-Cas系统
为了研究细菌如何应对CRISPR-Cas免疫系统所带来的不利影响，通过对CRISPRCasdb数据库中所有的CRISPR-Cas系统进行了系统分析，发现了众多天然的CRISPR-Cas屏障被IS转座所破坏（图1），推测了这一现象可能与有益外源基因的获取相关。随后，研究人员通过一系列分子生物学与遗传学实验在实验室条件下成功模拟了CRISPR-Cas免疫系统与基因水平转移之间的进化权衡关系。实验结果表明，宿主菌株在经历抗生素胁迫的巨大压力下，IS元件通过转座至cas基因，实现宿主菌与带有protospacer序列的外源抗生素耐药质粒的凤凰涅槃以及宿主菌在抗生素存在的环境中得以永生。
为了进一步研究IS转座特性，研究人员利用具有单个效应蛋白的type II (SpCas9) 与type V (FnCpf1) CRISPR-Cas系统在大肠杆菌中构建了一套高效的IS元件捕获系统（图2）。该系统能够选择性地捕获和分析转座至cas基因的IS元件，为解析IS转座至CRISPR-Cas系统及其对细菌适应性进化的影响提供了有力工具。为了进一步探索IS元件转座至cas基因的诱因，研究人员对SpCas9-HF1蛋白的RuvC与HNH结构域分别进行了单突变与组合突变，获得了三种具有不同切割能力的蛋白突变体。这些突变体包括对靶标链进行单链切割的SpCas9-HF1 (D10A)、对非靶标链进行单链切割的SpCas9-HF1 (H840A)以及仅结合，不切割的SpCas9-HF1 (D10A & H840A)。通过大量的质粒侵染实验及PCR验证，研究人员发现只有当SpCas9-HF1蛋白对染色体进行双链DNA断裂时，才会诱发IS元件转座至cas基因（图2）。
图2.基于CRISPR-Cas建立高效的IS元件捕获系统
接着，研究人员基于密码子的简并性，对Cas核酸酶编码序列进行了三轮的迭代突变，使其DNA序列尽可能地规避IS元件识别的热点motif。然而，令人意想不到的是，即使对核酸酶编码序列进行了重构，仍然以IS1与IS10为主要的转座类型。通过对这两个元件的识别序列进行系统的比较分析，发现了正是由于这两个元件在靶标序列识别上呈现的巨大宽泛性潜能，才使得它们成为破坏CRISPR-Cas免疫系统的主要“武器”。
接着，研究人员在IS元件捕获系统中，异源整合了三种修复能力不同的NHEJ（non-homologous end joining）修复系统。他们发现，尽管IS的转座频率有所下降，但转座事件仍然发生。这一结果表明，原核生物可能无法单独依靠NHEJ系统完全修复CRISPR-Cas系统引发的DNA损伤。进一步凸显了IS元件在驱动菌株对环境适应性中的重要地位。最后，研究人员通过组合大量的生物信息学工具对整个NCBI数据库中古菌、细菌与病毒中IS元件的分布进行了系统分析。结果表明，IS元件广泛存在于细菌与古菌中，且各IS家族的拷贝数存在很大差异。IS元件的广泛分布意味着它们在不同宿主中可能发挥着关键功能，通过参与宿主的适应性进化过程，从而推动宿主基因组多样性和适应性演化。为了更深入地理解IS元件在宿主进化中的作用，研究人员还探究了IS元件与其他原核生物防御系统的相互作用。有趣的是，通过系统的筛查，发现IS1与IS10转座到除了CRISPR-Cas系统以外的12种不同的防御系统中，例如限制性修饰系统与基于环状寡核苷酸的抗噬菌体信号系统等（图3）。这意味着IS元件可能通过干扰宿主的遗传防御系统，从而增加宿主获取外源有益基因的能力，并促进其自身的适应性进化。
图3.IS1与IS10元件转座至多种不同的原核生物遗传防御系统
迄今为止，主要发现了两种可以失活CRISPR-Cas免疫系统的机制：一类是Acr蛋白（Anti-CRISPR proteins），通过直接结合Cas蛋白来抑制Cas蛋白和crRNA组装成活性复合物，或对crRNA进行降解。另一类是噬菌体利用编码的整合酶，通过自身的attP位点与宿主基因组中的attB位点发生位点特异性重组，将基因组序列整合至宿主的CRISPR array区域，从而干扰crRNA的转录与成熟。该研究揭示了另一种高效失活CRISPR-Cas系统的机制—IS元件转座拆除的CRISPR-Cas免疫系统（图4）。这一重要发现进一步拓宽了我们对CRISPR-Cas失活机制的认知范围。
图4.anti-CRISPR机制总览
综上所述，这项研究表明，IS元件通过破坏宿主免疫系统，促使细菌更容易获得有益外源基因，介导了细菌遗传防御和有益外源基因获取之间的进化权衡关系，揭示了IS元件如何与宿主免疫系统相互作用，导致适应性基因的获取和整合。通过深入了解IS元件在不同环境中转座的诱因和影响因素，我们可以更好地理解细菌的遗传多样性以及其在不同环境下的定殖、生存和进化策略，并为微生物学、生物技术等相关领域的研究和应用提供重要的指导和启示。
大会信息
会议名称 |2023（第九届）肠道微生态与健康研讨会
会议时间 |2023年11月
会议形式 |线下
会议地点 |上海（定向通知）
大会规模 |800人
主办单位|生物谷、梅斯医学
联合主办 |
复旦大学微生物组中心
上海交通大学生命科学技术学院
上海究本科技有限公司
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